熒光免疫層析工藝流程

熒光免疫層析技術(shù)（FICA）是基于抗原抗體反應(yīng)和層析現(xiàn)象的新型膜檢測(cè)技術(shù)。相較于膠體金技術(shù)，熒光免疫層析技術(shù)有著可定量分析和高靈敏度等特點(diǎn)，與此同時(shí)在試紙條制備上也有著更高的操作要求。簡(jiǎn)單為大家介紹一種熒光免疫層析工藝流程（僅供參考）

抗體標(biāo)記

1. 清洗

檢查熒光微球溶液外觀，確保無(wú)凝聚、無(wú)漂浮物等變質(zhì)情況。將熒光顆粒吹打混勻，量取50ul（0.5mg），加入至2ml干凈、已烘干的圓底離心管中，加入500ul清洗液吹打混勻，低溫16000r/min離心10min除去上清。

2. 活化

用活化液分別配制EDC溶液和NHS溶液各5ul（0.1mg）。取190ul活化液重懸熒光微球，吹打混勻。分別加入上述EDC溶液和NHS溶液成200ul體系，吹打混勻，水浴超聲5min。37℃，200r/min振蕩孵育30min后低溫16000r/min離心10min除去上清，分別用300ul和500ul活化液重懸、離心清洗一次。

3. 偶聯(lián)

在活化、清洗后的熒光微球中加入一定體積的標(biāo)記液（V=抗體標(biāo)記體系體積200ul-標(biāo)記抗體體積）重懸微球，加入標(biāo)記抗體0.05mg（由濃度換算成體積），吹打混勻，水浴超聲5min后37℃恒溫振蕩16000r/min*3h。

4. 封閉

加入已對(duì)半稀釋的200ul0.125%封閉液吹打混勻，水浴超聲5min后37℃，100r/min恒溫振蕩30min；再加入已對(duì)半稀釋的400ul0.063%封閉液吹打混勻，水浴超聲5min后37℃，100r/min恒溫振蕩30min。

5. 保存

低溫14000r/min*10min離心除去上清，加入100ul室溫保存液重懸（微球終濃度5mg/ml，抗體終濃度0.5mg/ml），吹打混勻。

處理結(jié)合墊

根據(jù)需要使用含不同組分（表面活性劑、封閉劑、保護(hù)劑）的緩沖液處理包被PVA的玻纖，37℃烘干。

緩沖液如：磷酸緩沖液、Tris、硼酸緩沖液、碳酸緩沖液、生物緩沖液等；

表面活性劑如：Tween-20、Tritonx-100、S9等；

大分子（封閉、保護(hù)）如：PEG4000、PEG20000、PVP、PVA等；

小分子（保護(hù)）如：糖類物質(zhì)（蔗糖、海藻糖等）；

惰性蛋白（封閉）如：BSA、OVA、Casein、Casein-Na等。

噴涂標(biāo)記抗體

根據(jù)項(xiàng)目檢測(cè)特點(diǎn)用保存液稀釋標(biāo)記抗體-微球至合適濃度，選擇性使用獨(dú)立質(zhì)控抗體一同噴涂在標(biāo)記墊上；設(shè)置劃膜噴金儀噴涂參數(shù)，預(yù)實(shí)驗(yàn)建議為2ul/cm，在結(jié)合墊上噴涂標(biāo)記抗體，37℃烘干4h。

劃線包被抗體

根據(jù)項(xiàng)目檢測(cè)特點(diǎn)選擇合適的包被抗體濃度，根據(jù)項(xiàng)目及所用抗體情況選擇C線的二抗，設(shè)置噴涂參數(shù)。預(yù)實(shí)驗(yàn)建議為1ul/cm，劃線后37℃過(guò)夜烘干。

組板

將吸水墊和制備好的標(biāo)記墊、樣品墊貼在硝酸纖維素膜上，根據(jù)檢測(cè)卡殼卡槽大小裁剪試紙條。

包裝

將裁切好的檢測(cè)條壓入檢測(cè)卡殼內(nèi)。

注意事項(xiàng)

1.熒光微球清洗后上清液應(yīng)該保證澄清，不應(yīng)該渾濁；
2.EDC溶液和NHS溶液要先配現(xiàn)用，配好的溶液應(yīng)無(wú)團(tuán)聚；
3.超聲過(guò)程中液體會(huì)濺到管壁上，需要間斷地輕甩離心管；
4.偶聯(lián)加入抗體時(shí)應(yīng)無(wú)顆粒狀沉淀產(chǎn)生；孵育時(shí)每隔半小時(shí)觀察是否有沉淀產(chǎn)生，如有，可水浴超聲5min；
5.標(biāo)記完成后4℃保存，過(guò)夜后觀察應(yīng)無(wú)沉淀。
6.項(xiàng)目不同、檢測(cè)指標(biāo)要求不同，工藝需要做適當(dāng)調(diào)整，可參考免疫層析工藝常見(jiàn)問(wèn)題及解決方法。