WS/T 677-2020人群維生素D缺乏篩查方法

中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布
2020-05-06 發(fā)布，2020-11-01實施

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標準起草單位：中國疾病預防控制中心營養(yǎng)與健康所、寧波市疾病預防控制中心、深圳市慢性病防治中心、深圳市計量質量檢測研究院、南京醫(yī)科大學、中糧營養(yǎng)健康研究院。

本標準主要起草人：楊麗琛、楊曉光、胡貽椿、金米聰、楊國武、周繼昌、汪之頊、賈健斌、王俊、陳曉紅、張協(xié)光、莫俊鑾、毛德倩、付志成、王睿、丁葉、周明、陳競、張森。

1 范圍

本標準規(guī)定了人群維生素D缺乏和不足篩查的指標、參考判定值和檢測方法。

本標準適用于人群維生素D營養(yǎng)狀況的判定。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 603 化學試劑 試驗方法中所用制劑及制品的制備
GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
WS/T 225 臨床化學檢驗血液標本的收集與處理

3 術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1 25-羥基維生素D 25-hydroxyvitamin D；25(OH)D

血液中維生素D的主要循環(huán)形式，穩(wěn)定性好，是公認的評價人體維生素D營養(yǎng)狀況的可靠指標，主要包括兩種形式：25(OH)D₂、25(OH)D₃，其中25(OH)D₃是血液中維生素D的主要存在形式。

3.2 維生素D缺乏 vitamin D deficiency

當人體血清（或血漿）25-羥基維生素D含量低于缺乏的參考判定值時，可判定為維生素D缺乏。

3.3 維生素 D不足 vitamin D insufficiency

當人體血清（或血漿）25-羥基維生素D含量低于正常人群的參考判定值，但高于缺乏參考判定值時，可判定為維生素D不足。

4 人群維生素D營養(yǎng)狀況判定指標及參考判定值

人群維生素D營養(yǎng)狀況判定指標及參考判定值見表1。

5 測定方法

5.1 血液標本的采集與保存

按附錄A規(guī)定的方法進行。

5.2 第一法：液相色譜串聯(lián)質譜法

按附錄B規(guī)定的方法進行。

5.3 第二法：化學發(fā)光免疫法

按附錄C規(guī)定的方法進行。

5.4 第三法：酶聯(lián)免疫法

按附錄D規(guī)定的方法進行。

附錄A

血液標本的采集與保存

A.1 標本采集

A.1.1 血液標本的采集

空腹靜脈血，取血方法依據WS/T 225 以及檢測方法的要求采集空腹靜脈血1mL。

A.1.2 采血管

根據所需血清或血漿，使用不同采血管分裝。

A.2 血清、血漿保

標本于2℃～8℃可穩(wěn)定7d，-20℃可穩(wěn)定12個月。若標本不能及時檢測，建議適量分裝后于-70℃以下存放標本，僅一次凍融。

附錄B

液相色譜串聯(lián)質譜法

B.1 原理

血清（血漿）中的25(OH)D2和25(OH)D3經甲醇/乙腈沉淀蛋白，采用正己烷萃取，氮氣吹干，用初始流動相復溶，使用液相色譜法分離，串聯(lián)質譜多反應監(jiān)測模式（MRM）檢測，同位素內標法定量，該方法可以分別測定25(OH)D₂和25(OH)D₃。

B.2 試劑和溶液

除非另有說明，本方法所有試劑均為分析純，水符合GB/T 6682中一級用水規(guī)定，溶液按照GB/T 603配制。

B.2.1 試劑

B.2.1.1 25(OH)D?₂標準品（C₂₈H₄₄O₂，CAS：21343-40-8）：純度＞98%或有證標準物質。

B.2.1.2 25(OH)D3標準品（C₂₇H_{44O2，CAS：19356-17-3）：純度＞98%或有證標準物質。}

B.2.1.3 同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂標準品（C₂₈H₄₁²H₃O₂，CAS：1217467-39-4）：純度＞98%。

B.2.1.4 同位素內標[²H₃]-25(OH)D₃標準品（C₂₇H₄₁²H₃O₂，CAS：140710-94-7）：純度＞98%。

B.2.1.5 甲醇（CH₃OH）：色譜純。

B.2.1.6 正己烷（C₆H₁₄）：色譜純。

B.2.1.7 甲酸（HCOOH）：色譜純。

B.2.1.8 牛血清白蛋白（BSA）：純度≥98%。

B.2.1.9 氮氣（N2）：純度≥99.9%。

B.2.1.10 甲酸-水溶液：0.1%。

B.2.1.11 甲酸-甲醇溶液：0.1%。

B.2.1.12 乙腈（CH₃CN）：色譜純。

B.2.1.13 BSA牛血清白蛋白水溶液：1%。

B.2.1.14 沉淀劑：甲醇+乙腈（1+1）。

B.2.1.15 標準儲備溶液（10μg/mL）：分別稱取25(OH)D₂和25(OH)D₃標準品1mg（精確至0.01mg）于2個100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。此溶液中25(OH)D₂和25(OH)D₃ 的濃度為10μg/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，-20℃下避光保存，備用。

B.2.1.16 同位素內標標準儲備溶液（10μg/mL）：分別稱取同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃ 1mg（精確至0.01mg），于2個100mL容量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度。此溶液中[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的濃度為10μg/mL。溶液轉移至試劑瓶中，-20℃下避光保存，備用。

B.2.1.17 標準系列溶液：分別準確移取25(OH)D₂（10μg/mL）和25(OH)D₃（10μg/mL）5μL、10μL、25μL、50μL、125μL、250μL和500μL于7個10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。此系列溶液的25(OH)D₂和25(OH)D₃的濃度為5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、125ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。

B.2.1.18 混合同位素內標溶液（100ng/mL）：分別準確吸取同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂儲備溶液（10μg/mL）和[²H₃]-25(OH)D₃儲備溶液（10μg/mL）各100μL，于10mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度。此溶液的同位素內標[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃的濃度均為100ng/mL。溶液轉移至試劑瓶中后，-20℃下避光保存，備用。

B.2.2 儀器和設備

B.2.2.1 分析天平，感量：0.0001g。

B.2.2.2 分析天平，感量：0.00001g。

B.2.2.3 液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀。

B.2.2.4 氮吹儀或真空離心干燥儀。

B.2.2.5 離心機：離心力≥12000×g。

B.2.2.6 旋渦混合器。

B.2.2.7 移液槍或移液器。

B.3 分析步驟

B.3.1 樣品制備

取血清（血漿）樣品200μL至2mL離心管中，加入20μL混合同位素內標溶液，渦旋振蕩30s。加入400μL沉淀劑（甲醇+乙腈，1+1），室溫下渦旋振蕩混勻30s；加入1.2mL正己烷，室溫下渦旋振蕩5min，然后在4℃和離心力大于12000×g下離心5min；吸取1.0mL上清液至1.5mL離心管中，室溫下用氮氣吹至干；用100μL初始流動相復溶，渦旋振蕩30s，4℃和離心力大于12000×g下離心5min，上清液轉移至進樣瓶中待LC-MS/MS分析。

B.3.2 標準工作溶液制備

取7個2mL離心管，分別加入180μL空白替代血清樣品（1%BSA牛血清白蛋白水溶液），以及20μL標準系列溶液（B.2.1）和20μL混合同位素內標溶液，此系列相當于0.5ng/mL～50ng/mL濃度范圍。旋渦振蕩30s。以下操作同B.3.1。

B.3.3 液相色譜-串聯(lián)質譜聯(lián)用儀參數(shù)設置

B.3.3.1 液相色譜分析參考條件：

a) 色譜柱：C₁₈柱（柱長100mm，柱內徑2.1mm，填料粒徑1.7μm，或者具同等柱效的色譜柱)；
b) 流動相：A相：含0.1%甲酸的水溶液；B相：含0.1%甲酸的甲醇溶液；
c) 梯度洗脫：見表B.1；
d) 流速：0.30mL/min；
e) 柱溫：40℃；
f) 進樣體積：10μL。

B.3.3.2 質譜測定參考條件：

a) 電離方式：電噴霧電離，正離子模式（ESI⁺ ）；
b) 檢測方式：多反應監(jiān)測模式（MRM）；
c) 氣簾氣：0.25MPa；
d) 噴霧電壓：4000V；
e) 去溶劑氣溫度：450℃；
f) 霧化氣：0.35MPa；
g) 去溶劑氣：0.35MPa；
h) MRM離子對參數(shù)見表B.2所示。

B.3.4 定性測定

在同一色/質譜條件下進行標準溶液和樣品溶液的測定，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標準溶液中檢出的色譜峰的保留時間一致，所選擇的離子對的質荷比也一致，而且樣品溶液中定性離子對的相對豐度與濃度相當?shù)臉藴嗜芤褐械亩ㄐ噪x子對的相對豐度比較，相對偏差也不超過表B.3規(guī)定的范圍，則可判定樣品溶液中存在該物質。

B.3.5 工作曲線的制作

在B.3.3的液相色譜和串聯(lián)質譜分析條件下，將B.3.2得到的標準工作溶液由低濃度到高濃度進行進樣分析，以25(OH)D₂和25(OH)D₃色譜峰，與其對應的同位素內標色譜峰的峰面積比值-濃度進行線性回歸，得到標準工作溶液的直線擬合方程，其線性相關系數(shù)應大于0.99。

B.3.6 樣品測定

在B.3.3的液相色譜和串聯(lián)質譜分析參考條件下，將B.3.1得到的待測樣品溶液進樣分析，按內標法計算待測試樣溶液中目標物的質量濃度。待測試樣溶液中的目標物的質量濃度應在標準工作曲線的線性范圍內，超過線性范圍則應適當稀釋樣品后再重復處理測定。

B.3.7 空白試驗

以1%BSA牛血清白蛋白水溶液代替血清（血漿）樣品，按B.3.1的步驟做空白試驗。

B.4 質量控制

B.4.1 內部質控

實驗室應制定測試結果質量控制程序，明確內部質量控制的內容、方式和要求。隨同樣品檢測需測定質量控制樣品，繪制質量控制圖，觀察測試工作的穩(wěn)定性、系統(tǒng)偏差及趨勢，及時發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象并采取相應的改進措施。

B.4.2 外部質控

實驗室應參加國內外實驗室認可機構組織的能力驗證活動，參加國際間、國內同行間的實驗室比對試驗。根據外部評審、能力驗證、考核、比對等結果評估檢驗結果的質量并采取相應的改進措施。

B.5 分析結果的計算

血清（血漿）樣品中25(OH)D2和25(OH)D3 的質量濃度按式（B.1）計算：

C_target=c......................................(B.1)

式中：
C_target——血清（血漿）樣品中目標物的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；
c——工作曲線中查出的樣品濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

注：結果用平行測定的算術平均值表示，保留小數(shù)點后一位，血漿(血清)中25(OH)D總含量為25(OH)D₂和25(OH)D₃含量相加。

B.6 精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。

B.7 檢出限和定量限

本方法25(OH)D₂、25(OH)D₃檢出限均為0.15ng/mL，定量限均為0.5ng/mL。

B.8 回收率

本方法的添加回收率為84.0%～106.0%。

B.9 25-羥基維生素D2和25-羥基維生素D3標準溶液LC-MS/MS色譜圖

25(OH)D₂和25(OH)D₃標準溶液的LC-MS/MS色譜圖見圖B.1，[²H₃]-25(OH)D₂和[²H₃]-25(OH)D₃標準溶液的LC-MS/MS色譜圖見圖B.2。

說明：圖B.1和圖B.2中峰1為[²H₃]-25(OH)D_3>；峰2為[²H₃]-25(OH)D₂。

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